مشخصه یابی آنزیم های درگیر در سیستم تیوردوکسین وابسته به nadph از گیاه برنج (.oryza sativa l)

سیستم تیوردوکسین وابسته به nadph (nts) که متشکل از nadph، تیوردوکسین ردوکتاز وابسته به nadph (ntr) و تیوردوکسین h (trx h) می باشد، با احیای باندهای دی سولفیدی در پروتئین های هدف درگیر در فرآیندهای مختلف سلولی، دارای یک نقش تنظیمی پس از ترجمه در سلول است. بر خلاف سلول های پروکاریوت و پستانداران، گیاهان یک سیستم ntr/trx پیچیده شامل چندین ایزوفرم ntr و trx h دارند. بنابراین سوال مهمی که باید پاسخ داده شود این است که آیا برهم کنش بین ایزوفرم های مختلف ntr و trx h اختصاصی است یا خیر. با جستجو در پایگاه اطلاعاتی ژنوم برنج (oryza sativsa l.)، ما نه ژن بالقوه که trx h را رمز می کنند و چهار ژن بالقوه که ntr را رمز می کنند شناسایی کردیم. فرم های تراریخت دو ایزوفرم osntr (osntr1 و osntr2) و سه ایزوفرم ostrx h (ostrx1، ostrx20 و ostrx23) به طور دگرساخت در باکتری e. coli به صورت پروتئین های his-tag با مقادیر قابل توجه تولید و سپس با استفاده از کروماتوگرافی جذبی خالص سازی شد. این کار امکان بررسی برهم کنش in vitro بین ایزوفرم های مختلف ntr و trx h از یک موجود زنده را فراهم ساخت. به این منظور، پارامترهای کینتیکی osntrها در برهم کنش با سه ایزوفرم ostrx با استفاده از آزمون dtnb تعیین شد. نتایج این آزمون نشان داد که بر خلاف ostrx1 و ostrx23، ایزوفرم ostrx20 توسط osntr احیاء نشد. هر دوی osntr1 و osntr2 پنج برابر تمایل بیشتری به ostrx1 نسبت به ostrx23 داشتند. با این حال مقدار kcat برای هر دو ایزوفرم ostrx تقریباً مشابه بود. این نتایج نشان می دهد که برهم کنش ایزوفرم های ntr و trx در nts اختصاصی است. به علاوه، برای بررسی امکان احیای ایزوفرم های ostrx توسط گلوتاتیون (gsh)، احیای انسولین در حضور gsh و هر یک از ایزوفرم های ostrx اندازه گیری شد. ostrx20 به طور موثری توسط gsh احیاء شد که نشان می دهد احتمالاً سیستم گلوتاتیون مسئول احیای ostrx20 است. همچنین، در مطالعه ی حاضر تحمل سلول های بیان کننده ی پروتئین های تراریخت در پاسخ به تنش های اکسیداتیو مانند h2o2 و اتانول نسبت به شاهد از طریق رسم نمودار رشد آن ها مقایسه شد. در مقایسه با سویه های بیان کننده ی osntr2، سویه های بیان کننده ی osntr1 میزان رشد بیشتری در حضور h2o2 و اتانول داشتند. علاوه بر این، سویه های بیش بیان کننده ی ostrx23 و ostrx1 به ترتیب در مقایسه با ostrx20 میزان تحمل بیشتری در حضور h2o2 نشان دادند، در حالی که میزان تحمل اتانول تفاوت قابل ملاحظه ای بین این سویه ها نداشت. ما همچنین برای اولین بار سویه هایی تولید کردیم که پس از تلقیح iptg قادر به بیان هم زمان osntr1 با هر یک از ایزوفرم های ostrx بود. برای این منظور محصول های pcr تولید شده متشکل از پروموتر، جایگاه اتصال ریبوزوم و هر یک از ژن های رمزکننده ی ایزوفرم های ostrx به پلاسمید pet-28a حاوی ژن osntr1 الحاق شد. به این ترتیب سه ساختواره حاوی ژن های رمزکننده ی osntr1/ostrx1، osntr1/ostrx20 و osntr1/ostrx23 تولید و به باکتری e. coli انتقال داده شد. آماده سازی این سویه ها ما را قادر ساخت تا در محیط in vivo به بررسی برهم کنش osntr1 با هر یک از ایزوفرم های ostrx بپردازیم. از بین این سویه ها، تحمل سویه ی هم بیانی osntr1/ostrx1 در پاسخ به تنش h2o2 بیشتر از سویه های بیان کننده ی osntr1 یا ostrx1 تنها بود. این نتایج نشان می دهد که osntr1 برهم کنش بالاتری با ostrx1 در محیط in vivo دارد که در توافق با نتایج آزمون های in vitro است.